Продольное транскраниальное измерение функциональной активации в мозге крысы методом диффузной корреляционной спектроскопии

  1. Аннотация. Нейронная активность является важным биомаркером для наличия нейродегенеративных заболеваний,...
  2. 2. Методы
  3. 2.1. обезболивание
  4. 2.2. Электрическая стимуляция передней лапы
  5. 2,3. Функциональная магнитно-резонансная томография
  6. 2.3.1. Анализ данных
  7. 2,4. Диффузная корреляционная спектроскопия
  8. 2.4.2. Оптические приборы
  9. 2.4.3. Диффузно-корреляционная спектроскопическая проба
  10. 3. Результаты
  11. 3.1. Функциональная магнитно-резонансная томография
  12. Таблица 1
  13. 3.2. Диффузная корреляционная спектроскопия
  14. 4. Дискуссия

Аннотация.

Нейронная активность является важным биомаркером для наличия нейродегенеративных заболеваний, цереброваскулярных изменений и травмы головного мозга; кроме того, это суррогатный маркер для эффектов лечения. Эти патологии могут возникать и развиваться в течение длительного периода времени, поэтому неинвазивные, чрескожные методы необходимы для продолжения наблюдения. В настоящей работе мы настроили неинвазивную, чрескожную, диффузную корреляционную спектроскопию (DCS) для локализации изменений в мозговом кровотоке (CBF), вызванных нервной активностью. Мы смогли обнаружить изменения в CBF в соматосенсорной коре с помощью модели электрической стимуляции передних лап у крыс. Пригодность измерений DCS для продольного мониторинга была продемонстрирована путем проведения нескольких сеансов с одними и теми же животными в разных возрастах (от 6 до 18 месяцев). Кроме того, функциональная DCS была перекрестно проверена путем сравнения с функциональной магнитно-резонансной томографией (МРТ) у тех же животных в подмножестве моментов времени. Общие результаты, полученные с помощью чрескожного DCS, демонстрируют, что его можно безопасно и воспроизводимо использовать в продольных исследованиях для определения изменений CBF, вызванных нервной активностью в головном мозге мелких животных.

Ключевое слово: мониторинг компонентов крови или тканей, функциональный мониторинг и визуализация, спектроскопия, спекл

1. Введение

Изменения в активности нейронов приводят к локальным изменениям кровотока, чтобы увеличить кровоснабжение метаболически активных областей. 1 Нервно-сосудистая связь является одним из основных биомаркеров, используемых при исследовании функциональной активности мозга.

Функциональные методы нейровизуализации особенно интересны для изучения прогрессирования различных патологий. 2 - 6 влияет на центральную нервную систему, а также на различные механизмы восстановления, например, на функционально-потенцированное восстановление. 7 Это требует систем, которые не мешают развитию патологии или возможных методов лечения и позволяют изучать одних и тех же людей в течение длительных периодов времени.

Наиболее распространенным неинвазивным методом нейровизуализации является функциональная магнитно-резонансная томография (МРТ). МРТ основана на сигнале, зависящем от уровня кислорода в крови (BOLD), 8 что связано с концентрацией дезоксигемоглобина. К сожалению, на изменения в сигнале BOLD могут влиять сосудистая архитектура, внутренние гемодинамические реакции и другие факторы, такие как плотность вращения, объемная доля, уровни различных нейротрансмиттеров и перфузия. 9 Несмотря на то, что МРТ считается одним из наиболее применимых методов исследования нейрональной активности, он имеет некоторые недостатки, такие как доступность, стоимость и надежность.

С другой стороны, существуют методы относительно оптической визуализации, которые относительно недороги, которые не нуждаются в специальной инфраструктуре или использовании экзогенного контраста. Оптические методы могут обеспечить преимущества при изучении функциональной активации в головном мозге с помощью внутренних изменений, которые могут обнаружить изменения флуоресцентного света, поглощения или рассеяния света. Методы, такие как оптическая визуализация собственного сигнала (OISI), функциональная спектроскопия ближнего инфракрасного диапазона или фотоакустика, изучают изменения в объеме крови и насыщении крови кислородом из-за изменений концентрации окси- и дезоксигемоглобина, вызванных нейрональной активностью. 10 - 13 Косвенную информацию о мозговом кровотоке (CBF) можно получить, наблюдая за изменениями объема крови с течением времени с помощью контрастных веществ. Существуют оптические методы, которые непосредственно измеряют кровоток, такие как диффузная корреляционная спектроскопия (DCS), лазерная спекл-визуализация (LSI) и лазерная допплеровская флоуметрия (LDF). 14 - 18 Другие методы МРТ, такие как взвешенный объем церебрального кровотока (CBV), где внутрисосудистый контрастный агент необходим для мониторинга изменений CBV, вызванных местной нервной активностью, или маркировки артериального спина (ASL), которая локализует локальные изменения в CBF, имеют относительно низкое временное разрешение и низкое отношение сигнал / шум (SNR). 19

Оптические методы часто используются для визуализации гемодинамического ответа на различные функциональные раздражители в головном мозге мелких животных. LDF используется для количественной оценки изменений кровотока во время стимуляции на небольших моделях животных, однако он ограничен точечными и поверхностными измерениями ткани (<1 мм). 20 - 22 Другой метод, который часто используется, это LSI. БИС предоставляет двухмерные изображения и может измерять абсолютный кровоток, 23 , 24 но это также ограничено поверхностной визуализацией (<1 мм) гемодинамики. 16 , 25 , 26 Недостатком как LDF, так и LSI является то, что необходимо очистить, удалить или утончить череп в зависимости от вида. 23 , 25 С другой стороны, диффузные оптические методы, такие как ближняя инфракрасная спектроскопия (NIRS), DCS, 27 и спекл-контрастная оптическая томография (СКОТ) 28 позволяют неинвазивные измерения церебральной гемодинамики в глубоких тканях. 12 , 25 , 29 , 30 Как NIRS, так и DCS были использованы для измерения мозга грызунов транскраниально. 31 с ретракцией скальпа 27 , 28 и с имплантированными зондами в головах мышей для продольных исследований. 32

В настоящем исследовании мы объединяем мягкое седативное средство с транскраниальной DCS для измерения CBF при продольной (в течение нескольких месяцев) функциональной активации головного мозга из-за стимуляции передней лапы и для перекрестной проверки схемы активации с результатами, полученными с помощью МРТ у тех же крыс, используя рутинно Используется BOLD сигнал.

2. Методы

Все экспериментальные процедуры, связанные с использованием лабораторных животных, проводились в соответствии с руководящими принципами ARRIVE, местным и европейским законодательством и были одобрены Этическим комитетом по экспериментам на животных (номер одобрения 7883) Generalitat de Catalunya.

Одиннадцать крыс-самцов линии Вистар с массой тела (320 ± 50) г в начале эксперимента (в возрасте от 3 до 4 месяцев) первоначально использовали для фМРТ, и тех же крыс измеряли с помощью DCS в возрасте 6 и 18 месяцев. , Шесть экспериментов DCS были выполнены в возрасте 6 месяцев с периодом отдыха 15 дней между сеансами, и еще четыре эксперимента были проведены с теми же крысами в возрасте 18 месяцев [].

(а) Сроки проведения экспериментальных процедур. (б) Экспериментальный протокол для индукции анестезии и стимуляции сеанса. Пятнадцать минут в изофлуране (ISO) были посвящены расположению головок крыс на стереотаксической рамке (или на колыбели в экспериментах с МРТ). Через пятнадцать минут после инъекции медетомидинового болюса (MED) началась инфузия. Тридцать минут оставалось для успокоительной стабилизации перед первой электрической стимуляцией. Каждый сеанс состоял из шести последовательных экспериментов, чередуя стимуляцию правой и левой передней лапы. Прямоугольные импульсы (0,3 мс; 6 Гц; 2 мА) были использованы в пяти блоках (15-секундная активация и 45-секундный период отдыха каждый), и 5 минут оставалось для восстановления между экспериментами.

2.1. обезболивание

Крыс анестезировали 4% изофлураном в O 2: N 2 O (30:70). Животных помещали в стереотаксическую рамку (или колыбель для МРТ в экспериментах с МРТ) с лицевой маской, доставляющей ту же газовую смесь с 1,5% изофлурана, и вводили подкожный болюс (0,05 мг / кг) медетомидина (Domtor, Pfizer) , Изофлуран медленно прекращали в течение следующих 15 мин со скоростью 0,25% каждые 1 мин, начиная с 3 мин после болюса. В этот момент непрерывная подкожная инфузия медетомидина (1 мл / ч и 0,1 мг / кг) была начата в течение всего периода эксперимента.

Кожа головы крысы была выбрита с помощью электробритвы и крема для депиляции, чтобы избежать побочных эффектов в оптическом сигнале, производимом мехом. Две иглы подкожных электродов были введены в каждую переднюю лапу для стимуляции. Частота дыхания (количество вдохов в минуту) постоянно регистрировалась, а температуру тела контролировали ректальным зондом и поддерживали на уровне (37 ± 0,5) ° C с помощью электрического одеяла с обратной связью. Эксперименты по стимуляции начинали через 30 минут после прекращения приема изофлюрана, и у крыс было стабильное состояние с частотой дыхания от 40 до 50% по сравнению с исходными значениями.

После завершения эксперимента животные получали внутрибрюшинную инъекцию (0,1 мг / кг) атипемазола (Антиседан, Пфайзер), чтобы обратить эффект медетомидина.

2.2. Электрическая стимуляция передней лапы

Стимуляция передней лапы состояла из прямоугольных импульсов (2,0 мА, 6 Гц, 0,3 мс) в парадигме из пяти последовательных блоков 15-секундной стимуляции с последующим восстановлением в течение 45 с [] с общим временем 5 минут. Функциональный мониторинг активации проводился поочередно три раза для каждой передней лапы. Между экспериментами по стимуляции передних лап допускался период покоя в 5 минут [].

2,3. Функциональная магнитно-резонансная томография

Эксперименты по МРТ были проведены на 7,0 Т горизонтальном сканере BioSpec 70/30 (Bruker BioSpin, Эттлинген, Германия), оборудованном активно экранированной системой градиента (400 мТ / м, внутренний диаметр 12 см). Приемная катушка представляла собой четырехканальную поверхностную катушку с фазированной решеткой для мозга крысы. Функциональная визуализация активации была достигнута с помощью BOLD контрастного МРТ. Изображения коронального многослойного спинового эха (SE) EPI были получены с использованием следующих параметров: TE / TR = 30 = 3000 мс; BW = 150 кГц; пять последовательных срезов толщиной 2 мм; поле зрения = 2,56 × 2,56 см 2; матрица 64 × 64 пикселей.

2.3.1. Анализ данных

Статистические параметрические карты активации из BOLD fMRI были построены с помощью программного обеспечения STIMULATE. 33 Временной ход был исследован для каждого пикселя во время стимуляции передней лапы с использованием парного t-критерия Стьюдента с p <0,01 в качестве уровня значимости, где только статически значимые пиксели использовались для вычисления средней интенсивности BOLD-сигнала [Δ SI BOLD (%)].

Карты МРТ были рассчитаны без какой-либо предварительной фильтрации или определения пороговых значений сигнала. Кластеризация была выполнена с учетом не менее четырех смежных активированных пикселей.

Сигнал DCS был нормализован к 5-минутному исходному уровню до соответствующего эксперимента по стимуляции.

Статистический анализ проводился с использованием GraphPad Prism v4.0. Все данные представлены как (среднее ± SEM)%, где SEM - стандартная ошибка среднего. Чтобы проверить, коррелированы ли сигнал Δ SI BOLD и Δ rCBF, мы провели линейный регрессионный анализ и вычислили квадрат квадратного коэффициента корреляции Пирсона (r 2).

2,4. Диффузная корреляционная спектроскопия

2.4.1. Оптический метод

DCS является неинвазивным диффузным оптическим методом, который количественно измеряет глубокий кровоток в тканях. DCS измеряет временные спекл-колебания рассеянного света, которые чувствительны к движению рассеивающих частиц, таких как эритроциты. 14 , 34 Динамика рассеивателей определяется измерением автокорреляционной функции интенсивности, из которой выводится нормализованная электрическая автокорреляционная функция. Затем это согласуется с решением уравнения корреляционной диффузии для полубесконечной геометрии для получения эффективного взвешенного по числу рассеяния коэффициента броуновского движения (D B), который, как было показано, пропорционален индексу кровотока (BFI). 14 , 35 , 36 Относительный мозговой кровоток (rCBF) затем получают путем нормализации измеренного BFI с заданным исходным уровнем. 37

2.4.2. Оптические приборы

Свет вводился в ткань с помощью длинного когерентного лазерного источника при 785 нм (120 мВт, Crystalaser, Reno, Nevada) через многомодовое волокно. Свет собирали, используя восемь одномодовых волокон, и отправляли в два массива из четырех однофотонных лавинных фотодиодов (SPCM-AQ4C, Dumberry, Vaudreuil, Canada), соответствующих восьми (2 × 4) детекторам. Выход каждого детектора использовался для построения функции автокорреляции нормализованной интенсивности с использованием восьмиканального коррелятора (Correlator.com, Нью-Джерси).

2.4.3. Диффузно-корреляционная спектроскопическая проба

Зонд DCS состоял из восьми детекторов и двух исходных волокон (), с тремя разделениями источник-детектор 2.6, 5.5 и 9.1 мм соответственно. Зонд был помещен в держатель, предназначенный для слияния с манипулятором стереотаксической рамки, обеспечивая достаточно точное позиционирование и хороший контакт между головкой крысы и чрескожным зондом. Внешние ориентиры (глаза, уши и нос) использовались для ориентации и размещения зонда, поскольку череп и скальп не были повреждены, брегма не была видна и не могла использоваться в качестве контрольной точки.

Внешние ориентиры (глаза, уши и нос) использовались для ориентации и размещения зонда, поскольку череп и скальп не были повреждены, брегма не была видна и не могла использоваться в качестве контрольной точки

(а) Схема чрескожного зонда и его конструкция с разделением источник-детектор и (б) его расположение на головке крысы.

3. Результаты

Температура тела поддерживалась в физиологическом диапазоне (37,4 ± 0,2) ° С под изофлураном и при (37,1 ± 0,6) ° С с медетомидином, в то время как частота дыхания снижалась во время экспериментальной процедуры при использовании медетомидина в качестве седативного агента. Начальная частота дыхания, которая в изофлуране составляла (87 ± 21) ударов в минуту, снизилась до (55 ± 12) ударов в минуту после перехода на седативный эффект медетомидина и оставалась стабильной в течение следующих 1,5-2 часов, постепенно увеличиваясь после этого. Это временное окно считалось стабильным периодом для проведения экспериментов по стимуляции.

3.1. Функциональная магнитно-резонансная томография

Все крысы (n = 11) были первоначально подвергнуты фМРТ и показали нейрональную активацию в первичной соматосенсорной коре во время односторонней электрической стимуляции передней лапы.

В, мы показываем пример карты активации одного животного, стимулированного в правой передней лапе. Цветная карта показывает активацию в кортикальной соматосенсорной области (SIfl). Усредненное увеличение сигнала BOLD (%) из 11 животных во всех шести экспериментах (три стимуляции левой и трех стимуляций правой передней лапы) показано на рисунке, что приводит к среднему увеличению сигнала BOLD (4,3 ± 1,1)%, где профиль составляет пять можно наблюдать последовательные временные ряды периодов активации, составленные в каждом эксперименте. В, мы показываем данные от всех животных.

Таблица 1

Относительный rCBF от всех животных в возрасте 6 месяцев (неделя 0, неделя 2 и неделя 4) и в возрасте 18 месяцев (неделя 52 и неделя 54) представлен как Δ rCBF (%) (среднее значение ± SEM). Результаты МРТ представлены как [Δ SI BOLD (%)].

Техника МРТ DCS Животное Δ SI BOLD (%) Δ rCBF (%) Неделя 0 Неделя 0 Неделя 2 Неделя 4 Сгруппированы (6 месяцев) Неделя 52 Неделя 54 Сгруппированы (18 месяцев) Крыса 1 4,3 ± 1,3 22,8 ± 3,2 21,9 ± 4,8 20,2 ± 3,6 21,6 ± 2,9 18,4 ± 3,6 16,3 ± 3,7 17,3 ± 3,1 Крыса 2 3,9 ± 0,8 17,0 ± 4,3 16,1 ± 4,9 15,9 ± 3,4 16,2 ± 3,5 16,1 ± 3,3 14,2 ± 3,7 15,1 ± 2,9 Крыса 3 4,5 ± 2,0 27,8 ± 4,4 24,7 ± 2,6 25,9 ± 5,5 26,1 ± 4,1 23,6 ± 4,2 21,0 ± 3,4 22,2 ± 1,7 Крыса 4 4,0 ± 0,8 20,4 ± 3,9 20,9 ± 2,8 23,4 ± 4,7 21,6 ± 1,5 21,2 ± 4,7 16,9 ± 3,0 19,0 ± 2,2 Крыса 5 4,5 ± 1,2 22,4 ± 3,8 27,9 ± 5,8 26,7 ± 6,1 25,6 ± 5,2 25,8 ± 5,9 24,6 ± 5,4 25,2 ± 5,6 Крыса 6 4,2 ± 1,2 22,4 ± 4,6 16,3 ± 3,8 24,7 ± 5,6 21,1 ± 3,7 19,5 ± 2,8 17,1 ± 3,7 18,2 ± 2,1 Крыса 7 4,1 ± 0,4 20,3 ± 4,0 16,7 ± 3,4 17,2 ± 3,7 18,0 ± 3,2 19,3 ± 3,9 17,4 ± 2,6 18,3 ± 3,3 Крыса 8 4,6 ± 0,7 25,6 ± 4,2 20,4 ± 3,8 23,7 ± 5,0 23,2 ± 1,9 23,2 ± 4,4 19,1 ± 3,4 21,1 ± 1,8 Техника МРТ DCS Животное Δ SI BOLD (%) Δ rCBF (%) Неделя 0 Неделя 0 Неделя 2 Неделя 4 Сгруппированы (6 месяцев) Неделя 52 Неделя 54 Сгруппированы (18 месяцев) Крыса 1 4,3 ± 1,3 22,8 ± 3,2 21,9 ± 4,8 20,2 ± 3,6 21,6 ± 2,9 18,4 ± 3,6 16,3 ± 3,7 17,3 ± 3,1 Крыса 2 3,9 ± 0,8 17,0 ± 4,3 16,1 ± 4,9 15,9 ± 3,4 16,2 ± 3,5 16,1 ± 3,3 14,2 ± 3,7 15,1 ± 2,9 Крыса 3 4,5 ± 2,0 27,8 ± 4,4 24,7 ± 2,6 25,9 ± 5,5 26,1 ± 4,1 23,6 ± 4,2 21,0 ± 3,4 22,2 ± 1,7 Крыса 4 4,0 ± 0,8 20,4 ± 3,9 20,9 ± 2,8 23,4 ± 4,7 21,6 ± 1,5 21,2 ± 4,7 16,9 ± 3,0 19,0 ± 2,2 Крыса 5 4,5 ± 1,2 22,4 ± 3,8 27,9 ± 5,8 26,7 ± 6,1 25,6 ± 5,2 25,8 ± 5,9 24,6 ± 5,4 25,2 ± 5,6 Крыса 6 4,2 ± 1,2 22,4 ± 4,6 16,3 ± 3,8 24,7 ± 5,6 21,1 ± 3,7 19,5 ± 2,8 17,1 ± 3,7 18,2 ± 2,1 Крыса 7 4,1 ± 0,4 20,3 ± 4,0 16,7 ± 3,4 17,2 ± 3,7 18,0 ± 3,2 19,3 ± 3,9 17,4 ± 2,6 18,3 ± 3,3 Крыса 8 4,6 ± 0,7 25,6 ± 4,2 20,4 ± 3,8 23,7 ± 5,0 23,2 ± 1,9 23,2 ± 4,4 19,1 ± 3,4 21,1 ± 1,8

(a) Карта активации BOLD fMRI во время стимуляции правой передней лапы, наложенная на анатомические изображения T2-w. Активированная область соответствует области передних конечностей соматосенсорной коры (SIfl). (б) Усиление сигнала BOLD в среднем от всех крыс (по шесть экспериментов каждая). Изменение увеличения сигнала составило (4,2 ± 1,6)% [(среднее ± SEM)%].

3.2. Диффузная корреляционная спектроскопия

После введения болеобразования медетомидином и прекращения приема изофлурана рефлексы роговицы и хвоста отсутствовали, за исключением двух животных, у которых медетомидин не вызывал седативного эффекта, вероятно, из-за высокого уровня стресса, и, следовательно, были исключены. Кроме того, одно животное умерло из-за респираторных заболеваний. После исключения этих животных в общей сложности восемь крыс завершили все пять сеансов измерений DCS.

В каждом эксперименте по стимуляции самый сильный сигнал был получен от второй пары (L-2 или R-2), за исключением одного животного, где сигнал был лучше в парах источник-детектор L-3 и R-3. В показанном животном показано одновременно измеренное изменение rCBF в обоих полушариях. Кора головного мозга, противоположная стимулу, показала изменения в rCBF, тогда как результаты ипсилатеральной коры остались неизменными.

Схема стимуляции от коры: (а) противоположна стимулу и (б) ипсилатеральна стимулу. Графики соответствуют паре источник-детектор L-2 и R-2 соответственно. Профиль пяти последовательных последовательностей стимулов очевиден в контралатеральном полушарии, тогда как ипсилатеральное полушарие не показывает значительных изменений в CBF.

показывает пять различных сеансов от репрезентативного животного, три сеанса в возрасте 6 месяцев (неделя 0, неделя 2 и неделя 4) и два сеанса в возрасте 18 месяцев (неделя 52 и неделя 54). Исследование проводилось с периодом отдыха 2 недели между каждым экспериментальным кластером. На каждом графике показаны изменения в rCBF, усредненные по шести последовательным экспериментам (три стимуляции правой и трех левых передних лап), по парам источник-детектор L-2 и R-2 и представлены в виде среднего значения ± SEM. Относительный CBF составил (22,4 ± 3,8)%; (27,9 ± 5,8)%; и (26,7 ± 6,1)% для недели 0, недели 2 и недели 4 соответственно в возрасте 6 месяцев и (25,8 ± 5,9)%; (24,6 ± 5,4)% для последних сеансов в возрасте 18 месяцев. Статистический анализ [дисперсионный односторонний анализ (ANOVA), p <0,05] не выявил существенных различий между сеансами одного и того же животного. В, мы показываем данные по отдельным неделям и животным, усредненные по всем шести последовательным экспериментам. Изменчивость сигнала МРТ составляет от 2% до 4%. 38 и в оптике изменение сигнала составляет около 10% в соответствии с литературой. 26 , 39

Полный набор экспериментальных сессий от представителя животного. Каждый сюжет состоит из шести экспериментов по стимуляции передней лапы (три правой передней лапы и три левой передней лапы). (а) сеансы в возрасте 6 месяцев (взрослая жизнь, неделя 0) с периодом отдыха 2 недели между сеансами (недели 2 и 4) и (б) сеансы в возрасте 18 месяцев (пожилые люди, недели 52 и 54). Изменения CBF, измеренные с помощью DCS, не показали статистически значимых различий во времени (односторонний ANOVA; p <0,05).

Чтобы посмотреть на воспроизводимость результатов в долгосрочном исследовании, сигнал был усреднен по парам источник-детектор L-2 и R-2 (за исключением одной крысы, где сигнал был сильнее для L-3 и R- 3) с последующим внутрисубъектным средним для всех крыс и сгруппированным по возрасту. Эти результаты дают сходный профиль активации в зрелом возрасте и после старения (). Среднее значение Δ rCBF в группе за 6 месяцев составило (21,7 ± 3,2)%, а через год (19,5 ± 2,8)% - у тех же животных. Статистический анализ не показал значимых различий между группами (р <0,05).

Изменения в rCBF (в среднем у восьми крыс), вызванные функциональной активностью мозга, измеренные в зрелом возрасте (6 месяцев) и в пожилом возрасте (18 месяцев). Процентное изменение rCBF не показало существенной разницы (непарный t-тест; p <0,05).

Линейная регрессия () показывает положительную корреляцию с квадратным коэффициентом корреляции Пирсона (r 2), равным 0,7 между сигналом BOLD и Δ rCBF в возрасте 6 месяцев [] и 0,6 в возрасте 18 месяцев [] с р <0,05 для обоих случаев. Корреляция между Δ rCBF через 6 и 18 месяцев показана при r 2 = 0,8 и р <0,05.

Анализ линейной корреляции между измерениями BOLD и DCS, а также между измерениями DCS в двух временных точках. (а) ΔrCBF через 6 месяцев положительно коррелирует с изменениями интенсивности сигнала BOLD (корреляция Пирсона r 2 = 0,7, р <0,05). (б) ΔrCBF через 18 месяцев положительно коррелирует с BOLD (% SI) с корреляцией Пирсона r 2 = 0,6 и р <0,05). (c) Корреляция между Δ rCBF (%) через 6 и 18 месяцев (r 2 = 0,8, р <0,05).

4. Дискуссия

Настоящая работа демонстрирует, что DCS является полезным инструментом для изучения функциональной активности мозга в продольном направлении, от нескольких недель до года, неинвазивным способом у крыс. Данные, полученные с помощью чрескожного зонда DCS, были надежными и воспроизводимыми. Результаты были сопоставимы с МРТ.

Хотя DCS использовался в прошлом для измерения тканевого кровотока и его изменений в животных моделях патологий головного мозга, таких как инсульт 32 , 37 или послеродовая гипоксия, 40 он не использовался для мониторинга изменений кровотока в продольном направлении.

Для перекрестной проверки нашей системы мы сравнили измерения DCS с fMRI, хорошо охарактеризованным методом измерения активности мозга. DCS измеряет изменения CBF в микроциркуляторном русле, 14 тогда как ФМРТ (BOLD) чувствителен к локальным изменениям концентрации дезоксигемоглобина, вызванным гемодинамическим ответом на раздражитель. 41 , 42 Хотя DCS и fMRI измеряют разные параметры, оба предоставляют сходную информацию о гемодинамической активности, отражающей нейроваскулярное соединение, и являются хорошим индикатором гемодинамического ответа, вызванного нейрональной активностью неинвазивным способом.

Большинство методов в оптике измерения CBF, такие как LDF 21 , 22 , 43 , LSI, 23 , 24 или OISI, 26 Требуется удаление кожи головы и / или истончение черепа, чтобы избежать возможности маскировки воздействий от внешних тканей на измерения или для увеличения SNR. Все эти хирургические вмешательства несут в себе риск инфекции и / или воспаления, которые могут вызвать изменения в сосудистой сети экстракраниальных тканей, а также образование рубцовой ткани. Это также может привести к локализованному воспалению области мозга, наиболее близкой к истонченному черепу, из-за нагревания, вызванного сверлом. 44 Любая из этих реакций может вызвать локальные изменения в CBF. Кроме того, одной из целей экспериментов с маленькими животными является получение данных, сопоставимых с данными, полученными у пациентов, с которыми обычно невозможно использовать инвазивные зонды.

DCS был проверен на различных моделях животных для измерения rCBF 27 , 45 под различными протоколами анестезии, 46 но, насколько нам известно, не было проведено никаких исследований на крысах с неповрежденной кожей головы и черепом, чтобы проводить продольные исследования в течение нескольких месяцев.

Гипоксия, инсульт, некоторые нейродегенеративные заболевания, помимо других патологий, вызывают хронические изменения в работе мозга. Таким образом, экспериментальные модели животных, которые имитируют такие патологии, необходимо изучать в продольном направлении, от дней, недель до лет. Кроме того, многие терапевтические стратегии могут представлять их эффекты постепенно, способствуя небольшим функциональным улучшениям, которые требуют наблюдения в течение длительного периода времени. Кроме того, продольные исследования позволяют отслеживать отдельные предметы во времени, а не полагаться на перекрестные исследования с несколькими людьми в разные моменты времени. В этой работе мы показали результаты на восьми крысах, измеренные повторно в взрослом возрасте (6 месяцев), и те же животные были измерены через 1 год (18 месяцев).

Наша экспериментальная парадигма состояла из электрической стимуляции передней лапы, проводимой под действием седативного эффекта. Оптимальный ответ нейронов на безболезненную электростимуляцию передней лапы был обнаружен при частоте стимуляции 6 Гц и согласуется с предыдущими публикациями, 47 таким образом, эксперименты DCS проводились на той же частоте, давая легко обнаруживаемый сигнал. Результаты как BOLD, так и rCBF согласуются с опубликованными результатами в литературе. 44 , 48 , 49

В экспериментальных исследованиях на животных важно использовать анестетики или седативные средства, которые иммобилизуют животное, чтобы избежать артефактов движения, уменьшить стресс и повысить воспроизводимость. 50 , 51 Наиболее часто используемые ингаляционные анестетики (галотан, изофлуран) могут мешать нормальной нервной деятельности и могут влиять на сосудисто-нервную связь. 44 , 50 , 52 , 53 Другие анестетики, которые сохраняют такую ​​активность, часто требуют использования парализующих агентов, с необходимостью интубации и механической вентиляции крысы, и часто с определенной степенью токсичности, что делает невозможным продольные исследования. В последнее десятилетие были внедрены различные методы анестезии / седации, которые позволяют проводить функциональные эксперименты неинвазивным и продольным способом. 44 , 48 , 54

В настоящей работе была использована широко утвержденная седативная система для МРТ. 44 , 48 , 49 Медетомидин, агонист α2-адренорецепторов, вызывает анальгезию, седативный эффект, расслабление мышц и анксиолиз. Тем не менее, это успокоительное имеет некоторые недостатки, которые следует учитывать: оно способствует снижению частоты дыхания, что может изменить базальные уровни CBF и CBV, 44 и увеличение изменчивости среди разных людей из-за глубины седации. Уровень стресса в начале эксперимента может затруднить достижение оптимальной седации. Поэтому некоторые животные были исключены из исследования. Тем не менее, все те люди, которые достигли удовлетворительного седативного эффекта, показали значительные изменения в CBF, вызванные стимуляцией передними лапами. Новые анестетики, такие как те, которые недавно использовались в МРТ 55 что минимально изменить физиологические параметры или нейрососудистую связь, можно было бы использовать в будущих исследованиях.

Глубина проникновения в DCS зависит от расстояния между источником и детектором на поверхности ткани. Наш зонд был разработан для обнаружения CBF в коре крысы примерно на трех разных глубинах для обоих полушарий []. Наилучший сигнал был достигнут со второй комбинацией пары источник-детектор (5,5 мм), которая измеряет глубину около 2 мм от поверхности, за исключением одного сеанса, где наилучший отклик был у третьей пары источник-детектор (9,1 мм). ) для одного животного. Если мы рассмотрим толщину кожи головы и черепа, фактическая глубина сканирования соответствовала коре, в соответствии с зоной активации в соматосенсорной коре, обнаруженной с помощью МРТ. Количество пар источник-детектор в нашем зонде было ограничено для улучшения временного разрешения. В будущем зонды могут быть реализованы путем увеличения числа источников и детекторов, охватывающих большую площадь и глубину в коре головного мозга, что позволяет составлять точные карты активации. 14 , 28 , 31 , 56 , 57

Мы показали воспроизводимость результатов с небольшой вариабельностью при сравнении одного и того же человека в разные моменты времени или при сравнении между разными людьми. Несмотря на это, следует отметить определенную степень изменчивости измерений CBF. Вклад экстрацеребральных тканей в измеренный CBF во времени должен быть рассмотрен. Старение увеличивает толщину кожи и содержание жира в мягких тканях на протяжении всего эксперимента (∼ 1 год). Изменения в механизме сосудисто-нервного взаимодействия могут происходить со старением вследствие таких эффектов, как утолщение стенки сосуда и снижение эластичности. 58 Другие факторы, связанные с возрастом (гипертония, диабет), должны приниматься во внимание при проведении продольных исследований независимо от патологии, представляющей интерес. В будущем мы полагаем, что с помощью чрескожной DCS будет возможно изучать старение и нейрососудистое взаимодействие неинвазивным способом у пожилых животных.

Кроме того, случай небольшого смещения при расположении чрескожного зонда в правильном месте может вызвать различия в измеренных значениях CBF, поскольку электрическая стимуляция передней лапы вызывает дискретный гемодинамический ответ в небольшой области коры головного мозга. Таким образом, правильное размещение зонда является проблемой для рассмотрения. Внешние ориентиры, такие как положение глаз, ушей и носа, использовались для локализации Bregma в качестве ориентира для размещения зонда. Тем не менее, эти ориентиры могут незначительно отличаться у разных людей, а также с ростом головы со старением, что может добавить компонент изменчивости к измерениям.

Есть еще место для дальнейших улучшений. Отметим здесь, что мы следовали литературе и использовали для поглощения 0,1 см - 1 и для уменьшенных коэффициентов рассеяния 15 см - 1. 30 С другой стороны, это было показано ранее в литературе 59 что ошибки в базовых оптических параметрах минимально влияют на высокие относительные изменения CBF, особенно потому, что уменьшенный коэффициент рассеяния существенно не изменяется из-за функциональных стимулов. Кроме того, текущее исследование было доказательством принципа, чтобы показать, что мы можем видеть изменения в CBF в течение длительного времени (1 год). Можно использовать более сложные системы (томография) или модели, но для них потребуются другие протоколы и зонды. В дальнейшем измерения меняются новым методом SCOT 28 даст преимущества, измеряя CBF через неповрежденную кожу головы с большим количеством детекторов.

Используемый алгоритм предполагает однородный фон среды, что может быть проблематично в случае высоких поглощений и для небольшого разделения источник-детектор. Приближения более высокого порядка или модели Монте-Карло могут обеспечить более точную оценку переноса света в ткани, 60 введение неоднородностей для верхних слоев, таких как череп.