Микрофлюидные чипы для дифракции рентгеновских лучей in situ и динамического рассеяния света in situ для последовательной кристаллографии

Эпоксидная смола является отличным наполнителем для изготовления рентгеновских чипов. Это дешево, просто и надежно в обработке, не требуя специальных инструментов ( рисунок 1 ). Снижение эпоксидной вязкости путем разбавления его 40 мас.% Этанолом облегчило удаление избытка смолы над кристаллизационной лункой, что привело к определенным окнам рентгеновского излучения. Более высокие разбавления этанола привели к дефектам в отвержденной смоле. Анализируя поперечные сечения рентгеновских чипов, мы определили, что общая толщина окна с обеих сторон составляет около 19 мкм, что очень близко к номинальной толщине используемых полиимидных пленок 2 × 7,5 мкм ( рис. 2 ).

Испытания по кристаллизации были выделены в несколько реакционных отделений размером с нанолитер, каждое с использованием механизма капиллярного клапана, как описано ранее41. Этот метод загрузки «сохранить, затем создать» позволяет избежать потери пробы из мертвого объема канала и может быть легко выполнен вручную, что устраняет необходимость использования насосов или другого оборудования для приведения жидкости в действие42. Чип заливается фторсодержащим маслом перед загрузкой водного образца. Поверхностное натяжение на границе раздела масло-вода между грунтовочным маслом и водным образцом приводит к разности давлений на границе раздела. Это давление Лапласа зависит как от радиуса кривизны, так и от поверхностного натяжения поверхности раздела. Чтобы минимизировать свою энергию, интерфейс должен минимизировать свою поверхность, что эквивалентно максимизации его основных радиусов кривизны при постоянном объеме. Интерфейс с низкой кривизной в широком канале имеет более низкое давление Лапласа, чем интерфейс с высокой кривизной в узком сегменте канала. Следовательно, пробка пробоотборника предпочтительно входит и протекает через широкий обходной канал, а не через узкие ограничения капиллярного клапана. Наконец, проба пробоотборника сопровождается фторсодержащим маслом для разделения лунок для проб на независимые капли.

Надежная и надежная нагрузка была достигнута при расходах до 1 мл / ч как при последовательном, так и при параллельном расположении скважины ( рис. 3 ). В «последовательной» схеме сужения впускного и капиллярного клапанов последовательно соединены через байпасный канал31. Напротив, в «параллельной» схеме два отдельных основных канала соединяют все входы скважин или только капиллярные клапаны43. Обе концепции расположения ранее были объединены с контролем состава для скрининга состава, что является полезным аспектом при кристаллизации белка43,44. Серийный дизайн имеет только два порта для жидкости, один вход и один выход. У него меньше жидкостных портов, и поэтому его проще строить и эксплуатировать. Параллельная схема имеет 4 отверстия для жидкости, 2 для основного канала, соединяющего скважины, и 2 для соединения капиллярных клапанов, чтобы позволить воздуху или избытку масла вытекать. Следовательно, загрузка может осуществляться с обеих сторон основного канала. Эта схема имеет общее более низкое сопротивление потока для равного числа скважин из-за его более короткого обхода. Следовательно, он лучше подходит для устройств с большим количеством скважин. Кроме того, лунки для образцов ориентированы ближе друг к другу, что дает преимущества для автоматической визуализации.

Полная загрузка лунки для образцов наблюдалась для обоих макетов, если они были построены в виде двух или трех высот. В конструкции с двумя высотами и лунка для образца, и обводные каналы имеют одинаковую высоту. Конструкция с тремя высотами требует третьей маски, дополнительного слоя SU8 и этапа выравнивания, чтобы дополнительно гарантировать, что лунки для образцов станут выше, чем предыдущие обходные каналы. Этот перепад высот способствует проникновению пробы жидкости в скважину по тому же принципу капиллярного клапана, который останавливает поток в сужениях. Здесь более высокий потолок скважины соответствует более низкому давлению Лапласа продвигающегося мениска, и поток вдоль направления обхода поддерживается только после того, как скважины полностью заполнены, так что сужения клапана блокируют дальнейший поток и отклоняют его вниз по обходу. Тем не менее, для успешной загрузки не требуется, чтобы скважины были выше, чем перепускной канал, так как соответствующая капиллярная арматура также может быть достигнута путем соответствующей регулировки ширины канала. Тем не менее, по нашему опыту, более высокие скважины работали значительно более надежно, и нагрузка без дефектов наблюдалась при скоростях до десяти раз более высоких во всех конструкциях с тремя высотами по сравнению с их эквивалентами двух высот. Этот эффект был более выражен в параллельной компоновке.

Чтобы имитировать кинетику диффузии паров, конечная проницаемость полиимидной фольги использовалась для контроля испарения воды во времени. Экспериментальные скорости испарения были количественно определены путем мониторинга изменения объема капель с течением времени путем выравнивания площади поверхности капли и высоты скважины ( рис. 4C ). Испарение из кристаллизационных скважин в рентгеновском чипе не происходит линейно, так как уменьшающаяся площадь поверхности капли, совпадающая с увеличением концентрации растворенного вещества, приводит к снижению скорости испарения с течением времени45. Начальное испарение следовало приблизительно за линейной скоростью около 0,5 нл / ч в скважинах с геометрией серийного расположения.

Чтобы лучше понять кинетику кристаллизации, измерения DLS были выполнены в лунках кристаллизации микрофлюидного чипа. Для начальных измерений DLS использовалась микросхема PDMS, прикрепленная к предметному стеклу, чтобы обеспечить лучшие оптические свойства для эксперимента по рассеянию света. Этот чип имел те же размеры, что и рентгеновский чип. PDMS имеет более высокую проницаемость для водяного пара, чем полиимид полиимидных окон в рентгеновском чипе45. Поскольку поток масштабируется линейно с расстоянием, траекторию испарения полиимидной оконной скважины можно сопоставить с соответствующим окном PDMS соответствующей толщины.

Результаты DLS показывают, что распределение радиуса изменяется во времени ( Рисунок 4A- B ), демонстрируя, что измерения DLS позволяют обнаружить начальное зародышеобразование до того, как будут обнаружены первые кристаллические частицы. Эта информация может использоваться для зародышеобразования и роста монокристаллов на лунку путем внешней корректировки скорости испарения и, следовательно, уровней перенасыщения на ранней стадии нуклеации46.

Рентгеновский чип был закреплен на адаптере для 3D-печати для совместимого с SBS пластинчатого гониометра на линии луча EMBL синхротрона P14 в PETRA III ( рис. 5А ). В качестве альтернативы, для крепления рентгеновских чипов к стандартным гониометрам линии луча можно использовать меньшую 3D-печатную рамку21. Кристаллы тауматина имеют размер 10 - 20 мкм ( рис. 5В ) и дифрагируют до разрешения 2,0 Å ( рис . 5В ). Как и ожидалось, вклад фонового рентгеновского излучения двух окон из тонкой полиимидной фольги из рентгеновского чипа ограничен рассеивающими кольцами из полиимидного полимера при 11 Å (2θ ~ 5 °) и 33 Å (2θ ~ 1.7 °) для X длина волны 0,97 Å. Эти два кольца не мешают обработке данных. Был собран полный набор данных с 83 кристаллами тауматина и 10 дифракционных картин были записаны из каждого кристалла с поворотом на 1 ° в течение каждого кадра. Параметры обработки и уточнения данных, а также статистика набора данных тауматина перечислены и сравнены с двумя другими наборами данных глюкозоизомеразы и тиоредоксина, которые также были собраны in situ , перечислены в таблице 3 и таблице 4 .

Спад интенсивности нормализованной дифракционной мощности с течением времени исследовали путем разделения набора данных тауматина на пять наборов субданных (две дифракционные картины использовались на поднабор для поддержания полных наборов данных). Как показано на рис. 6В , дифракционная мощность начала уменьшаться после первого набора поднаборов и была ниже 50% в четвертом поднаборе данных. В результате значения Rmeas поднаборов данных также увеличиваются со временем, что указывает на повреждение рентгеновским излучением во время сбора данных. Мы предполагаем, что свободные радикалы, образующиеся во время рентгеновского облучения, быстро разлагают соседние кристаллы в том же реакционном отсеке. Например, такое вторичное рентгеновское повреждение было менее выраженным в связанном экспериментальном подходе, где кристаллы были распределены по значительно большей площади в сэндвич-полиимиде21. Чтобы минимизировать общее повреждение рентгеновских лучей, при комнатной температуре следует собирать только небольшое количество дифракционных картин от конкретного кристалла. Кроме того, только один единственный кристалл белка должен быть выставлен на отделение микрожидкостного чипа. Тем не менее, все структурные модели, уточненные с использованием обработанных наборов данных, показывают очень хорошую стереохимию и подходящую статистику ( таблица 4 ). Кроме того, все окончательные карты электронной плотности были очень хорошего качества.

В предыдущих кристаллографических подходах на рентгенопрозрачных чипах ориентацией и расположением кристаллов приходилось умышленно манипулировать, чтобы получить случайное распределение ориентаций кристаллов40, или это было получено при перемещении кристаллов внутри слоя жидкости21. Чтобы оценить ориентацию кристаллов в рентгенопрозрачных микрофлюидных чипах, описанных в этом протоколе, была определена ориентация элементарной ячейки всех экспонированных кристаллов относительно лабораторной системы координат. Для бипирамидальных кристаллов тауматина наблюдалось небольшое предпочтение ( фигура 7А ), в то время как мы получили широкое распределение для кристаллов глюкозоизомеразы ( фигура 7В ). Мы пришли к выводу, что в нанометровом масштабе большинство материалов демонстрируют значительную шероховатость. Следовательно, кристаллы могут самопроизвольно образовываться на поверхности в значительно менее предвзятых ориентациях спонтанно. Такое маленькое кристаллическое ядро ​​может быть зафиксировано в ориентации, продолжая расти до соответствующего размера без переориентации относительно нормали поверхности. Фактически, нуклеация кристаллов, опосредованная поверхностью поверхности, долгое время была проблемой для кристаллографов, пытающихся оторвать прикрепленный кристалл от поверхности, не повреждая кристалл в процессе. Здесь мы можем напрямую использовать такие кристаллы для сбора дифракционных данных. Тем не менее, существуют системные ограничения, так как тиоредоксин обнаружил сильное предпочтение определенных ориентаций в плоскостях xy, xz и yz ( рис. 7C ). Показанные примеры демонстрируют, что распределение ориентации зависит не только от среды выращивания, но и от формы кристалла. Кристаллы тиоредоксина имеют удлиненную форму, которая имеет тенденцию к росту в предпочтительной ориентации, в то время как кристаллы тетрагонального бипирамидального тауматина или кристаллы орторомбической глюкозоизомеразы не проявляют этого поведения. Однако во всех случаях, даже с предпочтительными ориентациями, доступный диапазон вращений кристаллов приводил к достаточно хорошему охвату реципрокного пространства и, следовательно, к полному набору данных для всех исследованных белков. Таким образом, никаких дополнительных мер не требовалось при выборе кристаллов для рентгеновского облучения.

Рисунок 1 : Схема изготовления микрожидкостного рентгеновского чипа. (1) SU-8 наносится на кремниевую подложку и покрывается методом центрифугирования для получения желаемой толщины слоя. (2) Фоторезист подвергается воздействию УФ-излучения через маску. (3) Неэкспонированный фоторезист затем вырабатывается последовательным промыванием PGMEA и изопропанолом, что приводит к (4) мастеру SU-8 для дальнейших этапов литья. (5) наливается PDMS, и (6) после отверждения пресс-формы PDMS отслаивается от SU-8 master. (7a) Эпоксидный клей наносится на форму PDMS и (7b) активированная полиимидная фольга химически связана с эпоксидной смолой. (8) После отверждения полиимидную фольгу с тонкой эпоксидной пленкой с рисунком снимают с формы PDMS. (9) На последнем этапе устройство накрывают второй полиимидной фольгой, чтобы получить закрытый микрофлюидный чип с низким фоном рентгеновского фона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Фотография (слева) и микроскопические изображения сечений конечных чипов. Представлены сегмент канала (в центре) и лунка для кристаллизации (справа) из двух отдельных чипов. Стрелки показывают измеренные расстояния. Все размеры указаны в мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Схемы конструкций кристаллизационных скважин с параллельным или последовательным расположением [A], если смотреть сверху и сбоку, с размерами, указанными в мкм. Типичные высоты канала составляли: перепускной канал 50 мкм, кристаллизационная лунка 50-60 мкм, капиллярный клапан 5-10 мкм, что соответствует объемам лунок примерно 2,5 нл (параллельная компоновка) и 8 нл (последовательная компоновка). Типичное поведение при загрузке хорошо показано при использовании пищевых красителей. Чип загрунтовали 12 мас.% 1Н, 1Н, 2Н, 2Н-перфтор-1-октанола в FC-43, прежде чем пищевой краситель впрыскивали в лунки для хранения. Белые стрелки указывают направление потока. Обзорные изображения загруженных устройств показывают все загруженные лунки без дефектов, иллюстрируя надежную загрузку образца. Параллельная компоновка иллюстрируется в виде конструкции с тремя высотами, причем кристаллизационные скважины выше, чем байпас, в то время как последовательная компоновка изображается в виде компоновки с двумя высотами, причем скважины и перепускной канал имеют равную высоту. Типичные скорости потока составляли около 150 мкл / ч во время загрузки, но бездефектная нагрузка наблюдалась при расходах до 1 мл / ч в конструкции с тремя высотами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Динамическое светорассеяние in situ кристаллизации с течением времени. [A] Микроскопическое изображение серии кристаллизационной скважины. Сохраняемая капелька непрерывно сжимается по мере испарения водяного пара со временем. Первые микрокристаллы тауматина могут наблюдаться через 4 часа. [B] Соответствующее гидродинамическое распределение радиуса частиц тауматина, измеренное DLS во время того же процесса кристаллизации, сфотографированного в [A]. Формирование фракции второго радиуса, указывающее на начальные события нуклеации, можно увидеть примерно через 1-2 часа. [C] Репрезентативное уменьшение объема двух контрольных объемов капель из-за потери воды в результате испарения с течением времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5 : сбор данных дифракции на месте . [A] Отдельные микрофлюидные чипы монтируются с помощью адаптера для 3D-печати (синего цвета) на пластинчатом гониометре. [B] Кристаллы тауматина в микрожидкостном чипе во время рентгеновского облучения, полученные с помощью встроенного микроскопа на линии луча P14. [C] Дифракция кристаллов тауматина регистрировалась до разрешения 2,0 Å с пренебрежимо низким фоном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6 : Оценка данных дифракции от кристаллов тауматина в микрофлюидном чипе, записанных при комнатной температуре. [A] Электронная плотность модели очищенного тауматина с использованием только набора данных кадра 1-2 (синие контуры при 1,5 σ). [B] Распад интенсивности кристаллов тауматина в зависимости от дозы рентгеновского излучения. [C] Эволюция значения Rmeas над дозой рентгеновского излучения. Квадратные графики в [B] и [C] с квартилями (верхние значения 75%, медианные значения 50%, нижние значения 25% и среднее) и усы с 95% -ными доверительными интервалами представляют затухание интенсивности дифракции и Rmeas всех экспонированных кристаллов. (n = 83). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7 : Распределение ориентации элементарных ячеек в микрожидкостной чиповой фольге относительно лабораторной системы координат. [A] Бипирамидальные кристаллы тауматина показали широкое распределение ориентаций, охватывающих почти 180 ° в плоскостях xy (синий), xz (зеленый) и yz (красный). [B] Изомераза глюкозы также имеет широкое распределение, в то время как [C] тиоредоксин демонстрирует сильное предпочтение определенным ориентациям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1-й слой: скважины 1000 об / мин 0/10 мин 200 мДж / см2 1/4 мин 15 мкм SU8-3010 2-й слой слой: Обход 2000 об / мин 0/16 мин 220 мДж / см2 1/5 мин 35 мкм SU8-3025 3-й слой: клапаны 3000 об / мин 0/3 мин 150 мДж / см2 1/2 мин 5 мкм SU8-3005

Таблица 1: Пример процесса SU8 для проектирования трехслойной параллельной рентгеновской микросхемы. Такое упорядочение слоев позволит отливать форму PDMS для изготовления рентгеновских чипов. Чтобы напрямую сформировать PDMS во время создания прототипа, измените порядок слоев во время изготовления мастера, чтобы начать с 3-го до 1-го слоя.

Тауматин ( Thaumatococcus daniellii ) 40 мг мл-1 50 мМ Бис-Трис, рН 6,5 1,1 М тартрат натрия, 50 мМ Трис, рН 6,8 I4222, 1LR2 29420 Глюкозоизомераза ( Streptomyces rubiginosus ) 25 мг мл-1 10 мМ HEPES, 1 мМ MgCl2, pH 7,0 100 мМ Bis-Tris, 2,7 М сульфат аммония, pH 5,7 I222, 4ZB2 46410 Тиоредоксин ( Wuchereria ) banc -1 20 мМ Трис-HCl, 5 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, рН 8,0 27,5% PEG1500, 100 мМ буфер SPG, рН 6,3 P41212, 4FYU 24075

Таблица 2: Условия кристаллизации и пространственные группы полученных кристаллов белка, включая коэффициент экстинкции и код pdb.

Thaumatin ( Thaumatococcus daniellii ) 103 10 1 40 1LR2 Глюкозоизомераза ( Streptomyces rubiginosus ) 69 100 0,1 80 4ZB2 Тиоредоксин ( Wuchereria Bancrofti ) 68 10 1 40 4FYU

Таблица 3: Параметр сбора данных рентгеновской дифракции.

Таблица 4: Статистика сбора данных наборов данных из тауматина, глюкозоизомеразы и тиоредоксина.

Файл дополнения 1: chip_geometry.dwg. CAD-файл используемой геометрии чипа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнения 2: goniometer_adapter.stl. STL-файл с указанием адаптера рентгеновского чипа гониометра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнения 3: xds.sh. Скрипт Bash для создания входных файлов для обработки клиньев дифракционных данных с помощью XDS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнения 4: xscale.sh. Скрипт Bash для объединения данных дифракции из подмножеств и создания файла HKL. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнения 5: ISigma.sh. Скрипт Bash для извлечения значений ISigma из всех отдельных подмножеств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнения 6: Rmeas.sh. Скрипт Bash для извлечения значений Rmeas из всех отдельных подмножеств. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Файл дополнения 7: вращение_matrix.sh. Скрипт Bash для подготовки входного файла для Matlab для расчета углов Эйлера по матрице вращения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Похожие

Комментарии