Организация машин репликации вируса гриппа

Вирус гриппа А представляет собой одноцепочечный РНК-вирус, который вызывает частые эпидемии, а также спорадические пандемии ( 1 ). Постоянная угроза пандемического гриппа подчеркивается появлением новых вирусов пандемического гриппа H1N1 в 2009 году ( 2 ) и потенциал высокопатогенных вирусов птичьего гриппа H5N1 для передачи от человека человеку ( 3 ). Некоторые исследования вируса гриппа указывают на то, что компоненты комплекса рибонуклеопротеинов (RNP) являются ключевыми факторами адаптации хозяина ( 4 ). RNP ответственны за вирусную транскрипцию и репликацию, а также за сборку сегментов генома в вирионы потомства ( 1 ).

RNP состоит из одной полимеразы, связанной с концами комплементарной РНК, и нескольких копий вирусного нуклеопротеина (NP), которые украшают длину каждого из восьми одноцепочечных сегментов вирусного генома, так что RNP напоминает большую петлю, скрученную в спиральная нить ( 5 ). РНК-полимераза состоит из PB1, каталитической субъединицы и PB2 и PA-субъединиц, которые несут активность для первичной транскрипции ( 1 , 6 , 7 ). Определены фрагменты кристаллических структур ( 8 ), но как субъединицы образуют функциональную полимеразу, взаимодействуют с NP и вирусным геномом или модулируют взаимодействия с факторами хозяина, до сих пор неясно.

Олигомеризация NP в нефизиологический тример, наблюдаемая в кристаллических структурах, облегчается введением длинной «петли хвоста» от каждого NP мономера в сайт связывания на соседнем мономере ( 9 ). Было показано, что «хвостовая петля» биохимически важна для олигомеризации мономеров NP внутри RNP ( 10 - 12 ), но отсутствует структурная информация о нативном RNP, и неясно, каким образом NP образуют структуры спиральной нити, которые характерны для RNP вируса гриппа ( 5 Электронно-микроскопические исследования ранее проводились на ограниченных мини-RNPs ( 10 через усечение РНК-генома до 254 нуклеотидов. Ожидается, что мини-RNP не будет повторять все взаимодействия нативных комплексов RNP, которые содержат 890–2,341 нуклеотидов, особенно при образовании нативно-подобных филаментов. Для решения множества биологических вопросов, связанных с RNP вируса гриппа, мы использовали cryo-EM для анализа структуры рекомбинантных RNP.

RNP были получены из сегментов 1, 2, 3 и 5 гена вируса гриппа, которые кодируют белковые компоненты комплекса RNP, используя систему на основе плазмиды ( 13 ). Совместная экспрессия белковых компонентов RNP с вирусными геномами облегчает сборку in vivo нативных комплексов RNP с вирусной транскрипцией и репликационной активностью. РНП на электронных микрофотографиях очень гибки по своей длине ( Инжир. S1 ), но отображают регулярный диаметр и повторяют, позволяя 3-D реконструкцию трех основных областей: конца РНК-полимеразы, центрального филамента и закольцованного конца (, таблица S1 ) ( 5 , 14 ).

Крио-ЭМ реконструкция комплекса рибонуклеопротеинов вируса гриппа

(A) Композитная модель крио-ЭМ реконструкций трех регионов РНП. ( B ) Карикатурное представление организации RNP. Большой домен полимеразы показан оранжевым, а домен руки красным. Нуклеопротеины показаны зеленым, а РНК синим. ( C ) Восстановление центральной области филамента с использованием спиральной симметрии. ( D ) Одиночные протомеры из кристаллической структуры NP ( 9 ) были вписаны в плотность EM. Расположение NP (светло-синий для нисходящей нити и темно-синий для восходящей нити) внутри нити создает периодическое расположение коробчатого типа, сформированное из четырех NP с областью низкой плотности или ямкой в ​​центре коробки. Эту коробчатую особенность также легко идентифицировать в наших реконструкциях концевых областей петли и полимеразы. Стрелки указывают на полярность РНК. Масштабная линейка представляет 10 нм.

Реконструкция центральной области филамента была выполнена путем выбора коротких перекрывающихся областей по длине RNP и применения спиральной симметрии на основе первоначального анализа несимметризованных реконструкций. Чтобы реконструировать оба конца RNP, предполагаемые концевые области RNP (тупые и концевые концы) были идентифицированы, отобраны и впоследствии классифицированы с использованием трехмерного подхода максимального правдоподобия ( 15 , 16 ) для отделения изображений конца цикла от конца полимеразы. Полимераза в реконструкции выделения была получена путем расщепления и разборки RNP с помощью рибонуклеазы. Трехмерные карты подвергаются фильтрации нижних частот с разрешением, обозначенным кривой коэффициента оболочки Фурье при 0,5. Обратные проекции всех 3-D реконструкций хорошо согласуются с их соответствующими средними 2-D классами ( Инжир. S2-S5 ).

Трехмерная крио-ЭМ реконструкция 23 нм сегмента центральной области нити RNP с разрешением 21 Å () указывает на то, что комплекс NP-РНК образует две антипараллельные цепи, которые скручиваются друг относительно друга с РНК-полимеразой и из нее, который связан с концом РНК ( 5 ). Одиночные NP протомеры, полученные из кристаллической структуры ( 9 ) были встроены в карту EM с помощью автоматизированных процедур стыковки с использованием структурных, биологических и симметричных ограничений ( 17 ) ( а также фильм S1 ). Вирус гриппа необычен среди РНК-вирусов тем, что транскрипция и репликация происходят внутри клеточного ядра ( 1 ). В подобранной модели N-концевой сигнал ядерной локализации NP (NLS I) подвергается воздействию, тогда как второй предполагаемый NLS (NLS II) скрывается на межбелковой границе ( Инжир. S6 ), в соответствии с исследованиями по мечению антител ( 18 ). Хотя карта скромного разрешения не допускает атомной интерпретации, расположение протомера и области NP могут быть локализованы внутри RNP. Модель согласуется с находкой ( 19 что «хвостовая петля» NP используется для олигомеризации вдоль цепи NP-RNA ( Инжир. S6 ) и потеря транскрипционной активности, когда остатки в NP "хвостовой петле" мутированы ( Инжир. S7 ) ( 10 - 12 ). Спираль RNP стабилизируется одной цепью NP-РНК, взаимодействующей с антипараллельной цепью NP-РНК вблизи доменов головы NP ( Инжир. S8 ) ( 20 ). Ориентация NP также направляет предложенные NP-РНК-связывающие области в межцепочечный интерфейс NP-NP, так что последовательности РНК, которые наиболее тесно связаны с NP, не являются непосредственно доступными для транскрипции или репликации, и предполагает, что, по крайней мере, локальная разборка RNP требуется для этих процессов.

В этой центральной области соседние протомеры NP поднимаются на 32,6 Å и скручиваются на 73,9 °, в среднем 4,9 NP вдоль нити РНК за один оборот спирали ( 21 ). Средняя периодичность NP на геномной РНК составляет 32 рибонуклеотида ( 22 ) аналогичен диапазону периодичности нуклеотидов 26–32, рассчитанному ранее по ограниченному мини-RNP ( 10 , 23 , 24 ). Средняя периодичность связывания NP нативного RNP по понятным причинам несколько больше из-за его более расслабленной конформации. Кроме того, расстояние между сайтами NP-РНК-связывания оставляет открытыми большие участки РНК ( Инжир. S9 ), объясняя восприимчивость RNP вируса гриппа к рибонуклеазам ( 5 ). Некоторые из экспонированной РНК могут представлять сигналы сборки терминального генома для облегчения взаимодействия с другими сегментами гена и сборки вирусного генома в вирионы потомства ( 25 ). Эти сигналы будут представлены в пределах примерно шести NP или 19 нм от конца полимеразы RNP, в соответствии с недавними томографическими исследованиями вируса гриппа, где взаимодействия между собранными восемью RNP наблюдаются в пределах 13-17 нм от конца нити RNP ( 26 , 27 ).

Конец петли RNP был реконструирован по крио-ЭМ-изображениям с разрешением приблизительно 40 Å и демонстрирует, что нить NP-РНК делает крутой разворот к и от центральной области филамента (и Инжир. S10 ). Двумерные средние значения отрицательно окрашенного РНП показывают, что петля состоит из 5–8 мономеров NP. Наблюдаемое изменение, вероятно, связано с разной степенью разматывания центральной области филамента.

Связанный с полимеразой тупой конец RNP был реконструирован до разрешения 20 Å по крио-ЭМ изображениям. Гетеротримерная РНК-зависимая РНК-полимераза имеет два первичных домена: большой домен и меньший плечевой домен. Полимераза напрямую связывается с двумя NP на своем большом домене (и Инжир. S10 ) и примыкает к дополнительному мономеру NP. Наша реконструкция похожа на ранее опубликованные плотности ( 10 ); однако мы идентифицируем массу, ранее назначенную для полимеразы, как более вероятную, представляющую смежный дополнительный NP мономер ( рис S11 ). Структуру очищенной полимеразы определяли криоэлектронной микроскопией до разрешения 13 Å ( 28 ). Эта структура с более высоким разрешением может быть встроена в реконструкцию RNP-связанной полимеразы после перестройки домена плеча (). Конформационная изомерия домена плеча согласуется с наблюдениями, сделанными для полимераз других сегментированных РНК-вирусов отрицательного смысла ( 29 ) ( Инжир. S12 ). Домен плеча имеет размеры и форму, что указывает на то, что это С-концевой домен РА ( 30 ).

Вирус гриппа А представляет собой одноцепочечный РНК-вирус, который вызывает частые эпидемии, а также спорадические пандемии (   1   )РНК-полимераза вируса гриппа и ее взаимодействия на конце RNP

(A) Большой домен RNP-связанной полимеразы (оранжевый) покрывает центральную область филамента RNP. Один NP из второй цепи, который возник из центральной нити, следует за 3'-цепью РНК, поскольку он проходит за полимеразой, чтобы связаться с PA CTD (красный). ( B ) Крио-ЭМ реконструкция свободной полимеразы (слева) показывает, что она состоит из большого домена (оранжевый) и плеча, содержащего PA CTD (красный) ( 30 ). Конформация области плеча в RNP обеспечивается вращением вокруг оси рядом с основанием рычага (справа). ( C ) 2-D усредненные и необработанные изображения отрицательно окрашенных RNP, меченных 5 нм нанозолотом (верхняя и средняя панели соответственно), локализуют конец PB2 C в нижней части большого домена вблизи сайта контакта NP. На нижних панелях показаны двумерные проекции 21 Å RNP-связанной полимеразы с дополнительным кружком (обозначен стрелкой) под большим доменом полимеразы, соответствующим размеру нанолиста 5 нм для сравнения со средними значениями в двумерном классе. ( D ) Составное изображение конца полимеразы RNP было помечено для обозначения предполагаемых положений субъединиц на основе стыковки PA CTD, маркировки нанозолота С-конца PB2 и структурной гомологии с реовирусной полимеразой. Расположение нанометрового нанометра 5 нм, обозначающего С-конец PB2, показано в виде круга, обозначенного Au. Поскольку реконструкция сосредоточена на полимеразе, а RNP является гибким, под хорошо упорядоченными компонентами видна дополнительная плотность, соответствующая дистальным областям плохо выровненных нитей RNP.

Чтобы определить местонахождение субъединицы полимеразы PB2 в комплексе RNP, С-конец субъединицы полимеразы PB2 в RNP был помечен 5 нм нанозолотом и окрашен отрицательно. Золотая метка локализуется на основании большого домена полимеразы вблизи места контакта антипараллельного винтового винта NP (). Домен PB2 `627 'расположен рядом с C-концом PB2 ( 31 ). Птичьи вирусы, лишенные адаптивных мутаций на поверхности этого домена, особенно Glu627Lys, ингибируются фактором-хозяином млекопитающего, который препятствует ассоциации птичьей полимеразы с NP ( 32 - 34 ). Наша идентификация домена «627» возле сайта связывания NP на полимеразе предполагает прямую конкуренцию за связывание полимеразы между NP и ингибирующим фактором хозяина млекопитающего, что приводит к ограничению хозяина для большинства вирусов птиц.

NP-протомеры можно использовать в качестве маркеров пути вирусного РНК-генома рядом с полимеразой, поскольку вирусная РНК не наблюдается при разрешении нашей реконструкции. Одна нить NP-РНК связывается с полимеразой вблизи С-конца PB2, тогда как вторая нить NP-РНК отходит от спиральной нити для образования петли и затем связывается с полимеразой через С-концевой домен РА ( Инжир. S10 ). Эта организация помещает вторую цепь РНК в предполагаемый сайт связывания РНК PA-CTD ( 30 ). Мутации Arg566Glu или Lys574Glu в этом сайте связывания полностью отменяют транскрипционную активность ( Инжир. S7 ). Структурная гомология PA-CTD с N-концевым доменом реовирусной РНК-полимеразы ( 30 , 35 ) предполагает, что эта вторая цепь является 3'-концом генома, который направлен к активному сайту полимеразы на большом домене полимеразы; следовательно, первая нить является 5'-концом ( рис S13 ). Концы РНК с частично спаренными основаниями должны быть проксимальны к активному сайту полимеразы, чтобы 5'-проксимальный полиуридин растягивался поперек активного сайта, оставаясь связанным с 5'-концом, и облегчать предполагаемый механизм заикания полиаденилирования ( 36 ) (). Размещение комплементарных концов РНК в верхней части большого домена полимеразы подтверждается предыдущей реконструкцией полимеразы, связанной с небольшой РНК ( 37 ). Эти данные подтверждают модель синтеза РНК, где PA-CTD играет роль в подаче матричной РНК в активный сайт полимеразы.

Модели синтеза РНК вируса гриппа

(A) В покоящемся RNP, полимераза связана как с 5 ', так и с 3' концами, как и следовало ожидать в вирионах. Большой домен полимеразы и домен плеча окрашены в оранжевый и красный цвета соответственно. Нуклеопротеин имеет зеленый цвет, а геномная РНК светло-синего цвета для 3'-конца и темно-синего цвета для 5'-конца. Активный сайт (*) и полярность РНК были идентифицированы с использованием структурной гомологии с реовирусной λ3-полимеразой ( рис S13 ). ( B ) Вирусная транскрипция мРНК осуществляется с помощью действующей полимеразы. В этом процессе матричная РНК вытягивается из-под полимеразы, проходит через активный сайт, где она транскрибируется в покрытую мРНК (черная), а затем повторно инкапсулируется в комплекс NP-РНК, который скручивается, образуя RNP-подобную структуру , ( C ) Репликация вирусной РНК осуществляется с помощью второй полимеразы, приводящей к формированию зарождающегося РНП. Вторая реплицирующаяся полимераза связывает вновь синтезированный 5'-конец и инициирует инкапсуляцию вирусного генома с помощью NP 5–3'-образом, что приводит к формированию зарождающегося RNP.

На основании наших структурных моделей и включения дополнительных структурных и биохимических результатов из литературы, мы можем предложить модель вирусной транскрипции из RNP вируса гриппа (, Инжир. S14 , а также фильм S2 ). В состоянии до инициации РНК-концы являются парными основаниями рядом с активным сайтом полимеразы. Субъединицы PA и PB2 связывают и расщепляют мРНК хозяина, образуя закрытые праймеры для инициации транскрипции. Затем 3'-конец отсоединяется от 5'-конца и перемещается в активный сайт полимеразы. По мере продолжения транскрипции PA-CTD перемещает одноцепочечную РНК из нити RNP в активный сайт. По мере того как транскрипция достигает 5'-конца матрицы и петля РНК затягивается, 5'-конец остается связанным с полимеразой, позиционируя полиуридиновое растяжение поперек активного сайта. Полимераза заикается через эту область, вызывая полиаденилирование и терминацию транскрипции.

Репликация генома вируса гриппа отличается от транскрипции тем, что РНК-продукт не ограничен или полиаденилирован. Вирусная репликация включает производство промежуточного комплекса cRNP, состоящего из комплементарной РНК, полимеразы и NP. Затем cRNP выступает в качестве матрицы для синтеза вирусного генома. Предполагается, что во время репликации RNP действует только как матрица с РНК-полимеризацией, проводимой второй полимеразой ( 38 ). Изучение ЭМ-микрофотографий с отрицательным окрашиванием выявляет многочисленные комплексы RNP с разветвленным расположением, где меньший зарождающийся RNP, по-видимому, расщепляется от более крупного полноразмерного RNP (). Возникающие RNP с очень малой длиной, половинной или почти полной длины наиболее часто встречаются у концов нити RNP, как и ожидалось, для зарождающегося RNP, реплицирующегося на шаблон RNP полной длины ( Инжир. S15 ). Кроме того, в образцах RNP, содержащих меченую полимеразу, мы наблюдаем наличие полимеразы, находящейся на стыке меньшего RNP с полноразмерным RNP ( Инжир. S16 ). Наблюдение за разветвленными РНП и их предполагаемая идентификация в качестве промежуточных звеньев репликации согласуется с ранее проведенным биохимическим и структурным исследованием РНП вируса везикулярного стоматита, выделенных из инфицированных клеток ( 39 ). Эти данные подтверждают модель репликации вируса гриппа, где вторая полимераза действует на матрицу RNP, приводя к образованию зарождающихся комплексов RNP одновременно с репликацией вируса. Остается неясным, как вторая полимераза инициирует репликацию. Однако в нашей модели по мере продолжения репликации синтезируется новый 5'-конец, связанный второй реплицирующейся полимеразой (, Инжир. S17 , фильм S3 ). После связывания с 5'-концом первый NP-протомер добавляют к РНК продукта, смежной с доменом PB2 `627 'реплицирующейся полимеразы, инициируя инкапсуляцию вирусного генома или кРНК в направлении от 5' до 3 'и формируя зарождающийся RNP на матрице RNP придает комплексу разветвленный вид (). Эта модель описывает NP-капсидирование вирусного генома, инициируемого специфическим для последовательности связыванием полимеразы с 5'-концом РНК ( 40 ), одновременно с репликацией вируса, что объясняет инкапсуляцию NP вирусной РНК, а не РНК хозяина во время вирусной инфекции.

Формирование зарождающегося RNP во время репликации.(Верхняя панель)

Электронные микрофотографии отрицательно окрашенного образца RNP при высоком разведении показывают разветвленные RNP, которые, как предсказывают, являются промежуточными звеньями репликации. ( Нижняя панель ) Интерпретация разветвленных RNPs на верхней панели, показывающая, как репликация вирусной РНК в транс- положении второй полимеразой (красная) может привести к появлению зарождающихся комплексов RNP (темно-зеленый), ответвляющихся от матрицы RNP (светло-зеленый). Когда зарождающийся RNP движется от и затем обратно к матричной RNP-полимеразе, то есть от 3 до 5 'вдоль геномной матрицы, он будет удлинять комплементарную РНК и увеличивать ее длину. Масштабная линейка соответствует 100 нм.

Эти исследования дают новое понимание транскрипции, репликации вируса гриппа и адаптации видов хозяев и проливают свет на ядерную транслокацию и сборку вируса RNP. Эти данные также предполагают, что взаимодействие PB2-NP и конформационная перестройка PA-CTD являются потенциальными мишенями для новых терапевтических средств и демонстрируют полезность нацеливания на сайт связывания "хвостовой петли" NP ( 12 ). Наша модель также обеспечивает основу для разработки новых гипотез, чтобы рассмотреть, как вирусные белки и факторы хозяина взаимодействуют с RNP для экспорта и локализации ядер на плазматической мембране для сборки вируса.

Похожие

Житомир.info | Мед с лимоном: житомирянам советуют народные методы в борьбе против гриппа
... гриппа характерно для ослабленных лиц, у которых отмечаются иммунодефицитные состояния. Теплый зеленый чай с лимоном и медом - вот продукты, которые способны существенно улучшить иммунологические показатели организма и помочь ему избежать заболевания гриппом. Достаточным 30-40 дней систематического употребления меда с зеленым чаем, лимоном и другими фитопрепаратами, чтобы предотвратить заболевание «птичий» и «свиной» грипп, убеждают специалисты